Hiện tại, khi nhắc đến việc định lượng DNA hay RNA, hầu hết các nhà khoa học sẽ nghĩ đến kỹ thuật PCR định lượng hay QPCR (quantitative PCR). Nói một cách chính xác, QPCR là một dạng của kỹ thuật Real-time PCR nói chung. Trong kỹ thuật này, chúng ta cần phải có ít nhất một cặp mồi để nhân bản vùng gen mục tiêu cần định lượng. Song song đó, quá trình nhân bản sẽ được theo dõi bằng tín hiệu phát ra bởi mẫu dò huỳnh quang bám giữa 2 mồi. Để tiết kiệm chi phí, chúng ta có thể sử dụng chất nhuộm phát huỳnh quang bám vào sản phẩm PCR thay cho mẫu dò.
Nội dung
Real-time PCR không hẳn là hoàn hảo…
Mặc dù ra đời từ rất lâu nhưng cho đến nay kỹ thuật Real-time PCR vẫn đang gặp phải một số hạn chế sau đây:
- Kết quả định lượng hoàn toàn phụ thuộc vào đường chuẩn. Đường chuẩn được tạo ra bởi 4-5 mẫu DNA/RNA chuẩn, biết trước nồng độ. Nếu những nồng độ này được đo đạc sai thì kết quả của QPCR cũng sẽ sai theo.
- Chỉ phân biệt được sự khác biệt về hàm lượng DNA giữa 2 mẫu khi sự khác biệt này lớn hơn 2 lần (ví dụ, mẫu A có hàm lượng gen mục tiêu là 1000 bản sao, mẫu B phải có hàm lượng gen mục tiêu là dưới 500 hoặc hơn 2000 bản sao thì QPCR mới có thể phân biệt được)
- Rất khó phát hiện và định lượng được các trình tự gen hiếm, xuất hiện với tỷ lệ thấp so với những gen không liên quan khác (gen nền). Thông thường, khi sử dụng QPCR để định lượng gen mang đột biến (mutant) trong một quần thể gen không mang đột biến (gen hoang dại, wild-type) thì tỷ lệ gen mang đột biến phải dao động trong khoảng 1% đến 10% trên tổng số lượng gen.
- Kết quả bị sai lệch lớn khi có chất ức chế phản ứng trong mẫu DNA hoặc RNA.
PCR kỹ thuật số (digital PCR) được xem là PCR thế hệ thứ ba, sau Real-time PCR. Kỹ thuật này vượt qua những hạn chế vừa kể của Real-time PCR, cho phép định lượng chính xác các phân tử DNA, RNA mục tiêu.
Nguyên lý của PCR kỹ thuật số
Để giải thích nguyên lý hoạt động của PCR kỹ thuật số, tôi sẽ lấy quy trình của hãng Bio-Rad làm ví dụ. Một quy trình PCR kỹ thuật số của Bio-Rad hay còn gọi là PCR vi giọt kỹ thuật số (Droplet DigitalTM PCR, ddPCRTM) bao gồm 5 bước cơ bản.
- Chuẩn bị phản ứng PCR: Việc chuẩn bị phản ứng ddPCR tương tự như phản ứng PCR thông thường. Phản ứng cũng bao gồm các thành phần cơ bản như enzyme Taq polymerase, mồi, dNTP, ma-giê, v.v… và bổ sung thêm chất phát quang EvaGreen hoặc mẫu dò huỳnh quang TaqMan. Các mẫu DNA sẽ được bổ sung vào các phản ứng này. Tổng thể tích cuối cùng của phản ứng là 20 μL. Cũng giống như khi chạy PCR, bên cạnh các phản ứng cho mẫu xét nghiệm, kỹ thuật viên thường chạy thêm các phản ứng chứng dương (chứa DNA mục tiêu) và phản ứng chứng âm (không chứa DNA mục tiêu).
- Tạo vi giọt: Bằng một thiết bị đặc biệt của hãng Bio-Rad gọi là Droplet Generator, một phản ứng 20 μL ở trên sẽ được phân chia ngẫu nhiên thành 20.000 vi giọt có thể tích khoảng 1 nL. Mỗi vi giọt này chứa đầy đủ các thành phần của 1 phản ứng Real-time PCR như trên và trở thành 1 phản ứng tí hon. Các phân tử DNA sẽ được phân bố ngẫu nhiên vào các vi giọt này.
- Nhân bản DNA có trong vi giọt: Tất cả 20.000 vi giọt được tạo ra từ 1 phản ứng ban đầu sẽ được chuyển vào 1 giếng trong đĩa PCR 96 giếng và được đặt vào máy PCR thông thường. Khi chương trình luân nhiệt diễn ra, DNA có trong mỗi vi giọt sẽ được nhân bản như một phản ứng PCR thông thường. Tín hiệu huỳnh quang tạo ra do mẫu dò hoặc chất phát quang sẽ được tích tụ trong từng vi giọt, tùy vào số lượng DNA mục tiêu được phân bố vào vi giọt.
- Đọc tín hiệu trong vi giọt: Sau khi phản ứng PCR kết thúc, các vi giọt sẽ được phân tích bởi một thiết bị đọc huỳnh quang của hãng Bio-Rad. Thiết bị này hoạt động theo cơ chế giống như flow cytometer. Từng vi giọt trong mỗi ống chứa ở bước 3 sẽ được hút vào đường ống của thiết bị và lần lượt đi qua các đầu đọc tín hiệu huỳnh quang. Cường độ tín hiệu của mỗi màu huỳnh quang có trong mỗi vi giọt sẽ được đầu đọc ghi nhận lại. Hiện tại, máy đọc vi giọt của Bio-Rad đọc được 3 loại màu huỳnh quang khác nhau.
- Phân tích dữ liệu: Kết quả đọc của tất cả vi giọt được tạo ra từ từng phản ứng ban đầu sẽ được chuyển sang phần mềm phân tích trên máy vi tính. Đối với từng phản ứng 20 μL ban đầu, kết quả được phân tích bao gồm:
- Tổng số vi giọt (droplet) tạo ra được từ 20 μL phản ứng ban đầu, bao gồm vi giọt dương tính và vi giọt âm tính.
- Tổng số vi giọt dương tính (chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang cao hơn hẳn so với những vi giọt trong phản ứng chứng âm).
- Tổng số vi giọt âm tính (không chứa DNA mục tiêu và có cường độ tín hiệu huỳnh quang ngang ngửa với những vi giọt trong phản ứng chứng âm)
Dựa vào số lượng vi giọt dương tính và tổng số vi giọt tạo ra từ mỗi phản ứng ban đầu, phần mềm sẽ áp dụng mô hình phân phối Poisson để tính ra nồng độ DNA mục tiêu có trong 20 μL thể tích phản ứng ban đầu.
Ứng dụng của PCR kỹ thuật số
Với độ nhạy, độ chính xác và độ lặp lại cao
của mình, kỹ thuật PCR kỹ thuật số đang được ứng dụng ngày càng nhiều trong các lĩnh vực sau.
- Phát hiện các gen mang đột biến hiếm, xuất hiện ở tỷ lệ thấp trong các mẫu khối u ung thư phức tạp hoặc mẫu liên quan đến bệnh di truyền
- Phát hiện và xác định tỷ lệ của các DNA mang đột biến lưu hành trong máu bệnh nhân ung thư (kỹ thuật sinh thiết lỏng)
- Chẩn đoán di truyền không xâm lấn dựa trên máu mẹ
- Xác định chính xác biến thể số lượng bản sao (CNV) của các gen liên quan đến bệnh lý lâm sàng
- Định lượng vi-rút, vi khuẩn gây bệnh không thông qua đường chuẩn
- Nghiên cứu biểu hiện gen, đặc biệt với những mẫu khó như tế bào đơn (single cell) hoặc mẫu mô đúc trong paraffin (FFPE)
- Định lượng các sự kiện chuyển gen có trong GMO
- Đánh giá chất lượng thư viện trước khi giải trình tự theo kỹ thuật NGS
- Thẩm định kết quả giải trình tự NGS cho những đột biến ở tần số thấp
Bài viết thuộc bản quyền của Sinh Học Phân Tử Bên Giảng Đường.
10,516 total views, 4 views today
