Trong phản ứng PCR, các đoạn mồi (primer) đóng vai trò gần như quan trọng nhất. Bất kỳ một đặc tính vật lý hay sinh học nào của mồi nếu không đạt yêu cầu thì phản ứng PCR của bạn sẽ có hiệu suất nhân bản rất thấp hoặc thậm chí không thể diễn ra. Và một trong những yêu cầu thiết yếu nhất là các mồi PCR của bạn phải bám đúng vào trình tự gien mục tiêu!
Vậy, làm sao xác định được liệu các đoạn mồi bạn tham khảo từ một bài báo nào đó có thể bắt trên đoạn gien mục tiêu mà bạn muốn nhân bản? Bài viết sau đây sẽ giúp bạn trả lời câu hỏi này chỉ với một số bước thao tác rất đơn giản!
Bước 1: Chép lại trình tự 2 mồi xuôi và mồi ngược được nêu trong bài báo. Lưu ý, trình tự DNA trong các bài báo nếu không có chú thích đặc biệt thì tự hiểu đọc từ trái sang phải là chiều 5′ – 3′. Cặp mồi PCR dùng để minh họa cho bài viết này được sử dụng trong phản ứng nhân bản vùng promoter của gien mã hóa cho tiểu phần B của hóc-môn kích thích nang trứng (follicle stimulating hormone beta subunit (FSHB)).
Bước 2: Vào chương trình Primer-BLAST trên trang web NCBI. Đây là một chương trình online hoàn toàn miễn phí. Các đoạn mồi khi đưa vào chương trình này sẽ được so sánh với hàng trăm triệu trình tự được lưu trữ trong cơ sở dữ liệu GenBank của NCBI.
Bước 3: Nhập trình tự 2 mồi PCR vào 2 ô đầu tiên ở mục Primer Parameters.
Ở mục Primer Pair Specificity Checking Parameters chọn Database là “nr”. Cơ sở dữ liệu này bao gồm gần như tất cả các trình tự của GenBank nên xác suất kiếm được trình tự mà cặp mồi có thể bắt lên sẽ là cao nhất.
Chọn “Homo sapiens” cho mục Organism.
Các thông số còn lại giữ nguyên giá trị mặc định.
Bấm vào nút Get Primers để chạy chương trình.
Cách đọc kết quả kiểm tra mồi PCR
Nếu có bất kỳ trình tự nào trong GenBank khớp hoàn toàn với 2 mồi PCR của bạn, chương trình Primer-BLAST sẽ trả kết quả như hình bên. Trong kết quả này bạn sẽ thấy được:
- Tên gien mục tiêu (follicle stimulating hormone beta subunit (FSHB))
- Mã số truy cập gien (NG_008144.1)
- Kích thước sản phẩm PCR (product length = 88)
- Vị trí bắt của mồi PCR trên gien mục tiêu (từ nucleotide 4763 đến 4850.
Ngoài ra, bạn có thể tham khảo các tính chất vật lý của cặp mồi PCR như chiều dài, Tm, GC%, các cấu trúc bậc 2, v.v… ở mục Primer pair 1
Như vậy, chỉ qua 3 bước cơ bản với phần mềm Primer-BLAST, tôi đã có thể khẳng định rằng cặp mồi PCR trong bài báo trên bắt được đúng vào gien mục tiêu FSHB. Tuy nhiên, tôi chưa dám chắc rằng cặp mồi này chỉ bắt đặc hiệu lên gien FSHB chứ không bắt vào các gien khác. Trong bài viết kế tiếp, tôi sẽ chia sẻ cách kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi này.
11,708 total views, 1 views today
