Lần đầu được sử dụng vào những năm 1970, trải qua gần 50 năm, các enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme) đã và đang được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học. Đầu tiên phải kể đến là các quy trình tạo dòng gien, khi mà người ta dùng enzyme cắt giới hạn để xử lý sản phẩm PCR và plasmid để tạo nên plasmid tái tổ hợp, trước khi biến nạp vào tế bào nhận. Kế đến, trong khoảng nửa sau năm 2000, tại Việt Nam có khá nhiều công ty, viện nghiên cứu sử dụng enzyme cắt giới hạn trong quy trình PCR kết hợp điện di DNA trên gel agarose để phát hiện đột biến điểm liên quan đến hiện tượng kháng thuốc ở bệnh nhân, ví dụ: nhiều đột biến thay thế nucleotide xảy ra trên gien mã hóa cho polymerase của HBV tạo nên tính kháng của virus này đối với thuốc Lamivudine sử dụng trong điều trị viêm gan B mạn tính. Nhưng liệu những gì tôi vừa kể có phải là tất cả ứng dụng của enzyme cắt giới hạn?
Nội dung
Bạn có biết rằng enzyme cắt giới hạn còn đóng vai trò rất quan trọng trong các quy trình kỹ thuật tiên tiến nhất hiện nay tại Việt Nam? Đó là quy trình Real-time PCR trong phát hiện methyl hóa DNA, quy trình microarray trong sàng lọc bất thường di truyền thai nhi và quy trình giải trình tự thế hệ mới (NGS). Trong phạm vi của bài viết này, tôi xin chia sẻ ứng dụng của enzyme cắt giới hạn trong quy trình định lượng thể methyl hóa liên quan đến ung thư bằng Real-time PCR.
Ứng dụng của enzyme cắt giới hạn trong phát hiện methyl hóa DNA bằng Real-time PCR
Để dễ mô tả về nguyên lý, tôi xin lấy ví dụ bộ kit EpiTect Methyl II PCR của Qiagen dùng để định lượng số lượng thể methyl hóa của 94 gien liên quan đến ung thư phổi. Trong quy trình này, trước khi tiến hành Real-time PCR, mỗi mẫu DNA được chia thành 4 phản ứng khác nhau. Phản ứng đầu tiên không chứa enzyme cắt (Mo). Phản ứng thứ 2 chứa enzyme cắt nhạy với methyl hóa MSRE (Ms). Khi cytosine trong cặp đôi nucleotide CpG nằm trong vùng nhận diện của enzyme MSRE bị methyl hóa thì enzyme này sẽ không thể cắt DNA tại vị trí này. Vì vậy, về nguyên tắc, enzyme MSRE chỉ cắt được các DNA không bị methyl hóa và lượng DNA còn lại sau phản ứng cắt với enzyme này là DNA bị methyl hóa toàn phần.
Ngược lại, trong phản ứng cắt thứ 3 của quy trình này, chỉ có enzyme phụ thuộc methyl hóa MDRE được bổ sung vào. Enzyme MDRE này chỉ nhận diện và cắt DNA tại những vị trí được methyl hóa. Lượng DNA còn lại sau phản ứng cắt với enzyme MDRE sẽ là DNA không bị methyl hóa. Ống phản ứng thứ 4 thì chứa cả 2 enzyme MSRE và MDRE, dùng để phát hiện những DNA không bị cắt bởi enzyme cắt giới hạn.
Các sản phẩm cắt sau đó được nhân bản với cùng một bộ mồi giống nhau bằng kỹ thuật Real-time PCR và thu nhận giá trị Ct. Dựa trên kết quả tính toán giá trị delta Ct của sản phẩm cắt bởi MSRE (Ms) và MDRE (Md) với DNA không bị cắt (Mo), người dùng có thể suy ra tỷ lệ thể methyl hóa và không methyl hóa của 1 gien nào đó.
Mời các bạn cùng theo dõi quy trình thực hiện phản ứng với enzyme cắt giới hạn qua video sau (có phụ đề Việt ngữ)
[youtube-subtitles width=”640″ height=”360″ id=”GsWo8dCivWs” sub=”www.sinhhocphantu.net/wp-content/uploads/subtitles/Restriction Digestion of DNA – YouTube.srt”]
11,144 total views, 5 views today
