Tôi từng gặp nhiều anh, chị làm việc trong lĩnh vực sinh học phân tử và rất rành về PCR. Họ tỏ ra vô cùng tự tin khi bàn về thiết kế mồi, pha chế, tối ưu hóa một phản ứng PCR hoặc thậm chí là multiplex PCR, nhưng lại lừng khừng khi nghe tôi đề cập đến Real-time PCR. Qua những gì họ bộc bạch, tôi có cảm giác trong mắt họ Real-time PCR là một thứ gì đó rất khó hiểu, khó thiết kế, khó phân tích và rất đắt tiền! Gặp những trường hợp này, tôi thường cười và xởi lởi rằng “Cũng không quá khó đâu anh/chị à. Thậm chí, nếu ĐƯỢC thì anh/chị vẫn có thể chuyển phản ứng PCR của anh chị thành Real-time PCR chỉ trong…tíc tắc thôi ạ”.
Trong bài viết hôm nay, tôi sẽ mổ xẻ từ “ĐƯỢC” trên, nghĩa là những yếu tố bạn cần có để chuyển đổi nhanh chóng một phản ứng PCR thông thường thành Real-time PCR trong vòng…7 nốt nhạc! 🙂
Thứ nhất, tất nhiên lab của bạn phải có máy Real-time PCR. Có điều, máy Real-time PCR thì rất nhiều hãng cung cấp tại Việt Nam, từ Mỹ sang Âu, thậm chí qua đến Tàu cũng có. Cấu hình máy thì cũng đa dạng, đọc vào mấy bảng thông số kỹ thuật mà hoa cả mắt @@. Vậy thì máy của bạn cần phải có những đặc điểm gì để áp dụng các bước tiếp theo? Rất đơn giản, chỉ 1 đặc điểm quan trọng thôi: phải đọc được kênh màu huỳnh quang SYBR Green hoặc FAM. Bạn có thể tìm hiểu thêm về kênh màu này từ Google nhé.
Thứ hai, mua thêm một ống chất nhuộm DNA huỳnh quang chuyên sử dụng cho Real-time PCR gọi là SYBR Green hoặc EvaGreen. Nguyên lý hoạt động của loại chất nhuộm này rất đơn giản, tôi sẽ lấy EvaGreen làm ví dụ nhé. EvaGreen khi ở trạng thái tự do thì đã có thể phát tín hiệu huỳnh quang khi nhận được ánh sáng kích thích. Tuy nhiên, khi bám vào DNA mạch đôi, EvaGreen sẽ phát huỳnh quang cao gấp hàng ngàn lần so với trạng thái tự do. Như vậy, vào những chu kỳ đầu, số lượng sản phẩm PCR (DNA mạch đôi) còn ít thì tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng sẽ rất yếu. Nhưng khi trải qua nhiều chu kỳ, hàm lượng DNA mạch đôi tăng lên thì tín hiệu EvaGreen cũng sẽ tăng theo, giúp cho đầu đọc của máy Real-time PCR ghi nhận được.
Cách sử dụng EvaGreen cũng khá đơn giản. Ống EvaGreen bạn mua về thường có nồng độ cao, 100X. Bạn chỉ việc hút 1 lượng thể tích nhỏ bổ sung vào phản ứng PCR của mình sao cho nồng độ cuối của EvaGreen vào khoảng 0.5X – 1X là được. Ví dụ, nếu tổng thể tích phản ứng PCR của bạn (tính luôn lượng DNA cho vào) là 25 μl, bạn chỉ cần hút 0,25 μl EvaGreen 100X cho vào ống phản ứng để được nồng độ cuối là 1X.
Những thành phần còn lại của phản ứng PCR các bạn vẫn cứ giữ nguyên nhé!
Thứ ba, thiết lập chương trình luân nhiệt cho máy Real-time PCR. Đầu tiên, bạn sao chép toàn bộ chương trình luân nhiệt PCR mà bạn đang dùng vào máy Real-time PCR và cài đặt thêm lệnh đọc tín hiệu huỳnh quang tại bước “kéo dài” trong mỗi chu kỳ. Bạn có thể xem thêm tại Bài 7 – Real-time PCR – Phần 1.
Sau chương trình PCR, bạn thêm vào 1 bước phân tích đường cong nóng chảy (melting curve) của sản phẩm PCR (xem thêm tại SYBR Green trong Real-time PCR). Trong bước này, nhiệt độ phản ứng sẽ được nâng lên dần từ 55oC đến 95oC theo từng 0,5oC/lần. Sau mỗi lần nâng nhiệt, máy sẽ đọc tín hiệu huỳnh quang phát ra từ phản ứng, tức là máy sẽ đọc tín hiệu 80 lần trong bước phân tích này. Khi nhiệt độ phản ứng càng lúc càng cao thì các sản phẩm PCR mạch đôi có trong ống phản ứng sẽ bị biến tính thành dạng mạch đơn. Như đã nói ở trên, EvaGreen chỉ phát huỳnh quang mạnh khi bám vào DNA mạch đôi và khi lượng DNA mạch đôi này giảm xuống thì tín hiệu huỳnh quang của cả phản ứng cũng sẽ giảm theo. Theo nhiều tài liệu trên thế giới thì điểm nhiệt độ mà tại đó tín hiệu huỳnh quang giảm mạnh nhất chính là nhiệt độ nóng chảy (melting temperature, Tm) của sản phẩm PCR chủ đạo có trong phản ứng.
Vậy thì, tại sao bạn phải chạy thêm bước phân tích Melting Curve này? Câu trả lời là: “Để biết tín hiệu huỳnh quang tạo ra từ phản ứng là do sản phẩm PCR đặc hiệu chứ không phải do primer dimer gây ra”.
Theo nguyên tắc, EvaGreen sẽ bám vào bất kỳ phân tử DNA mạch đôi nào có mặt trong phản ứng và phát ra huỳnh quang. Thế nên, cho dù phản ứng của bạn không hề có sản phẩm PCR đặc hiệu mà chỉ cho các primer dimer thì bạn vẫn sẽ thu được đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vào những chu kỳ 35-40, và dẫn đến kết luận DƯƠNG TÍNH GIẢ! Để tránh trường hợp này xảy ra, bạn phải dựa trên kết quả phân tích Tm của tất cả các sản phẩm DNA mạch đôi có trong phản ứng. Tm của primer dimer thường rất thấp, khoảng 60-70oC, rất dễ phân biệt với Tm của sản phẩm PCR đặc hiệu, dao động trong khoảng 75-90oC.
Thứ tư, phải sử dụng tube 0,2 ml phù hợp với máy Real-time PCR. Vì đại đa số các máy Real-time PCR hiện có trên thị trường Việt Nam thường ghi nhận tín hiệu huỳnh quang xuyên qua nắp tube chứa phản ứng, nên bạn phải chắc chắn sử dụng đúng loại tube 0,2ml có nắp trong suốt (optical cap) chuyên dụng cho Real-time PCR.
Cuối cùng, ngoài lề một chút, tôi xin chia sẻ rằng với Real-time PCR sử dụng EvaGreen hay SYBR Green, bạn có thể nhân bản và phát hiện dễ dàng những đoạn gene rất ngắn, khoảng chừng 70-80 bp, điều rất khó thực hiện khi sử dụng PCR-Điện di thông thường (vì khó quan sát trên gel agarose). Tôi từng nhân bản và sử dụng phân tích Melting Curve để phát hiện thành công những đoạn DNA rất nhỏ này từ gene interleukin 28B của người trong đề tài nghiên cứu sinh của mình. Bạn chỉ cần có một chút kiến thức về sinh học phân tử để chọn được những vùng gene có Tm cao dùng cho thiết kế primer thì mọi chuyện sẽ trở nên rất dễ dàng.
16,274 total views, 5 views today
Để lại một phản hồi
Bạn phải đăng nhập để gửi phản hồi.