Khi nào nên chọn phương pháp PCR – Điện di?

Nếu các bạn theo dõi những bài viết của tôi trên trang web sinhhocphantu.net và nhóm Facebook Sinh Học Phân Tử Bên Giảng Đường, các bạn có thể thấy tôi rất ưu ái khi nói về Real-time PCR. Nào là “…đây là một kỹ thuật nhanh và nhạy”! Nào là “Real-time PCR vô cùng tiện lợi”! Nào là “không phải lo về ngoại nhiễm!” bla bla bla …. Vậy thì, có bao giờ các bạn nghi ngờ những điều tôi nói và tự hỏi “Tại sao ngày nay nhiều người vẫn sử dụng phương pháp PCR – Điện di thay vì dùng Real-time PCR?”. Nếu câu trả lời là có, bạn nên đọc bài viết bên dưới. Bài viết nêu lên một số ứng dụng đặc thù của phương pháp PCR – Điện di mà Real-time PCR khó lòng đáp ứng hoặc không cần thiết phải dùng đến.

Phát hiện đa mục tiêu trong cùng một phản ứng (multiplex PCR, PCR đa mồi) thật sự là một thế mạnh vượt trội của phương pháp PCR – Điện di mà khó có phương pháp sinh học phân tử nào cạnh tranh lại, nhất là Real-time PCR. Nếu các bạn muốn dùng Real-time PCR để phát hiện nhiều trình tự mục tiêu, các bạn cần phải lưu ý một số hạn chế quan trọng sau đây:

• Hệ thống máy Real-time PCR phải đọc được nhiều kênh màu huỳnh quang có phổ màu độc lập hoàn toàn với nhau, ví dụ 5-6 kênh huỳnh quang
• Bắt buộc phải sử dụng mẫu dò huỳnh quang với chi phí tổng hợp rất cao, khoảng 500-700 USD cho một mẫu dò, tùy vào màu huỳnh quang
• Số lượng trình tự mục tiêu tối đa có thể phát hiện là 5, vì phụ thuộc vào khả năng đọc của máy Real-time PCR
• Giá máy Real-time PCR 5 màu cao hơn máy PCR thường 6-7 lần, tùy hãng sản xuất

Chính vì những hạn chế vừa nêu của kỹ thuật Real-time PCR, tôi khuyên bạn nên sử dụng phương pháp PCR – Điện di nếu muốn phát hiện đa mục tiêu. Chỉ cần chú trọng một chút vào khâu thiết kế mồi, các bạn sẽ dễ dàng có ngay một phản ứng multiplex PCR với chi phí rất phải chăng! Hình bên là một ví dụ sử dụng PCR – Điện di để phát hiện 4 kiểu gen (genotype) vi-rút Human papilloma (HPV) khác nhau. Các kiểu gen này bao gồm HPV 16, 18, 6/11 và nhóm kiểu gen HPV nguy cơ cao khác (HRC). Các bạn có thể thấy trong giếng ngoài cùng bên phải chính là một phản ứng multiplex PCR. Trong phản ứng này người ta dùng 4 cặp mồi đặc hiệu cho 4 kiểu gen/nhóm kiểu gen HPV và 1 cặp mồi nhân bản gen chứng nội của người (1000bp). Kết quả điện di cho thấy 5 sản phẩm PCR với kích thước khác nhau cùng xuất hiện rõ ràng. Điều này chứng tỏ phản ứng multiplex PCR có thể nhân bản thành công cùng lúc 5 trình tự mục tiêu khác nhau!

“… tôi cũng từng phát triển thành công những phản ứng PCR phát hiện cùng lúc 8-11 trình tự mục tiêu khác nhau dành cho HPV nguy cơ cao. Trong thời gian gần đây, tôi cũng có dịp tiếp cận với các phản ứng PCR phát hiện được tới 18-22 vi-rút hoặc vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp, tiêu hóa trên người…” (Tác giả)

Giải trình tự gen theo phương pháp Sanger

Trong nghiên cứu và chẩn đoán, phương pháp giải trình tự theo nguyên tắc Sanger có vai trò rất quan trọng. Kết quả của nó gần như là một “tiêu chuẩn vàng (gold standard)”, dùng để xác nhận lại kết quả của những phương pháp khác, trong đó có Real-time PCR. Tôi xin liệt kê một số ứng dụng của phương pháp giải trình tự mà bản thân từng có cơ hội tiếp như sau:

• Xác định kiểu gen của vi-rút viêm gan siêu vi C dựa trên trình tự của vùng gen 5′-UTR và core
• Phát hiện đột biến gen EGFR, BRCA, KRAS, v.v… trong chẩn đoán một số loại ung thư như phổi, vú, đại trực tràng
• Định danh vi sinh vật dựa trên vùng gen 16s rRNA
• Phát hiện lệch bội nhiễm sắc thể ở thai nhi bằng các vùng gen STR (Single Tadem Repeats) (chỉ xem sự khác biệt rất nhỏ về kích thước sản phẩm PCR, không xác định cụ thể trình tự)

Trong quy trình giải trình tự theo phương pháp Sanger ở hình bên dưới, các bạn có thể thấy bước đầu tiên luôn là phản ứng PCR. Bước này có vai trò nhân bản chính xác những vùng gen mục tiêu cần để giải trình tự. Sau đó, sản phẩm PCR được tinh sạch từ gel điện di để loại bỏ hoàn toàn những sản phẩm phụ, mồi, enzyme, dNTP, v.v… Qua một số bước kế tiếp, sản phẩm PCR được dùng làm khuôn mẫu để tổng hợp nên những đoạn DNA ngắn có đánh dấu các màu huỳnh quang tương ứng với 4 loại nucleotide A, T, G và C. Cuối cùng máy điện di mao quản với đầu đọc huỳnh quang sẽ phân tích những đoạn DNA này và ghi nhận lại trình tự của sản phẩm PCR.

Phương pháp PCR – Điện di tạo dòng và biểu hiện gen

Trong giới nghiên cứu protein, người ta ít khi chú trọng hoặc thậm chí là không biết đến phương pháp PCR. Đây là mảnh đất độc tôn của các kỹ thuật ELISA, SDS-PAGE, Western blotting, điện di 2 chiều, sắc ký tinh chế, v.v… Tuy nhiên, nếu chịu khó để ý, các bạn sẽ thấy PCR dù ít xuất hiện nhưng vẫn thể hiện được tầm quan trọng của nó. Với quy trình tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong hình bên phải, phương pháp PCR – Điện di được sử dụng ở bước chuẩn bị gen mục tiêu trước khi lắp ghép với plasmid hay vector. Gen mục tiêu ở đây có thể là gen biểu hiện cho một protein nào đó của người hay sinh vật khác. Hai đoạn mồi sử dụng trong phản ứng nhân bản gen mục tiêu được thiết kế đặc biệt hơn bình thường. Đầu 5′ của 2 mồi này thường được gắn thêm trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn. Sản phẩm PCR được tạo ra bởi 2 mồi này sẽ mang trình tự của gen mục tiêu bên trong (màu xanh dương) và trình tự nhận biết của enzyme cắt ở đầu 5′ và 3′ (màu xanh lá và đỏ). Sau đó, sản phẩm PCR được đem ủ với enzyme cắt giới hạn để tạo ra 2 đầu mút ở dạng mạch đơn. Hai đầu mút này tạo điều kiện cho sản phẩm PCR được nối vào một plasmid (cũng xử lý trước đó bằng cùng enzyme cắt giới hạn). Plasmid tái tổ hợp sau đó được chuyển vào tế bào chủ, ví dụ E. coli, để tiến hành biểu hiện protein mục tiêu.

Bài viết thuộc bản quyền của Sinh Học Phân Tử Bên Giảng Đường.