Để minh họa cho việc ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR vào nghiên cứu các loại dược liệu ức chế tế bào ung thư, tôi xin lấy bài báo “Xây dựng một số tiêu chí kiểm soát chất lượng bài thuốc Hoàng Liên Giải Độc Thang dựa trên “Dấu vân tay hóa học” và “Dấu vân tay sinh học” của nhóm tác giả Nguyễn Thị Mỹ Nương làm ví dụ. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã sử dụng các phương pháp như sắc ký lớp mỏng, HPLC và Real-time RT-PCR để phân tích các đặc tính hóa học và sinh học của bài thuốc Hoàng Liên Giải Độc Thang (HLGĐT). Từ đó, nhóm tác giả đề xuất những tiêu chí cơ bản để đánh giá chất lượng của bài thuốc này.
Mục tiêu ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR trong nghiên cứu này là để xác định sự thay đổi biểu hiện gen khi tế bào được xử lý với thuốc. Đầu tiên, dòng tế bào ung thư cổ tử cung, HeLa được nuôi trên đĩa 6 giếng hoặc 24 giếng đến một mật độ phù hợp. Sau đó dịch chiết từ bài thuốc HLGĐT được bổ sung vào các giếng có tế bào ở nồng độ IC50 (đã xác định ở những công trình trước). Với các giếng đối chứng, dịch chiết được thay thế bằng nước cất. Kế tiếp, các tế bào được tách khỏi giếng để tiến hành tách chiết RNA tổng số và phiên mã ngược thành cDNA bằng enzyme RT. Cuối cùng, cDNA được bổ sung vào các phản ứng Real-time PCR với cặp mồi đặc hiệu cho một số gen quan tâm. Quá trình nhân bản được theo dõi bằng chất phát huỳnh quang EVAGreen. Các gen quan tâm này đã được nhóm tác giả xác định bằng một công trình trước đó bằng kỹ thuật microarray
Như các số liệu khảo sát 3 mẻ thuốc được trình bày trong bảng bên (trích từ bài báo), các bạn có thể thấy có 3 gen tăng biểu hiện một cách ổn định (giá trị CV% thấp nhất) là STC2, TRIB3 và GDF15. Từ kết quả ban đầu này, nói nôm na, chúng ta có thể ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR để đánh giá chất lượng của các mẻ thuốc HLGĐT từ đây về sau dựa trên mức biểu hiện của 3 gen này. Mẻ thuốc nào làm gen tăng biểu hiện rần rần sẽ được coi là “hàng xịn”. Mẻ thuốc nào đem ủ với tế bào xong, gen cứ nằm ì ra đó, không tăng cũng chẳng giảm, thì đích thị là “hàng lởm”, không hơn gì nước sâm, hột é bán dọc đường!
Khi thử lân la đọc thêm những bài báo khác trên thế giới, tôi thấy người ta cũng có đề cập đến 3 gen STC2, TRIB3 và GDF15. Sự biểu hiện của chúng đúng là có liên quan đến sự phát triển và di căn của tế bào ung thư cũng như kết quả điều trị. Còn liên quan cụ thể như thế nào thì các bạn có thể tự tìm hiểu. Tôi chỉ xin nói trước là kết quả rất thú vị đó các bạn ạ!
Một lưu ý quan trọng khi ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR trong khảo sát biểu hiện gen
Một trong những điều quan trọng nhất khi ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR trong khảo sát biểu hiện gen đó là xác định được gen đối chứng phù hợp nhất đối với từng thí nghiệm. Vậy gen đối chứng là gì? Gen đối chứng là những gen có biểu hiện đồng đều giữa tất cả các tế bào ngay cả ở những điều kiện thí nghiệm khác nhau. Điều kiện thí nghiệm khác nhau có thể được quyết định bởi loại thuốc, nồng độ thuốc, thời gian ủ, loại tế bào, v.v… Thông thường, bạn có thể thấy đại đa số các bài báo khoa học thường dùng gen ACTB hay GADPH làm gen đối chứng cho những thí nghiệm khảo sát biểu hiện gen bằng Real-time PCR. Tuy nhiên, về nguyên tắc, trước khi tiến hành đo đạc sự biểu hiện của gen mục tiêu, bạn nên khảo sát trước một vài gen đối chứng tiềm năng để chọn ra gen ổn định nhất cho các thí nghiệm của bạn. Như trong kết quả khảo sát 18 gen của loài cây chùm ngây Moringa oleifera ở hình bên, gen RPL2 được xem là gen đối chứng tiềm năng nhất vì mức biểu hiện của gen này là ổn định nhất trong nhiều loại mô khác nhau.
Bài viết thuộc bản quyền của Sinh Học Phân Tử Bên Giảng Đường.
3,949 total views, 1 views today
