Tôi từng làm công việc R&D tại một công ty tư nhân Việt Nam suốt hơn 6 năm trời. Trong khoảng thời gian hơi dài dài này, nhiệm vụ chính của tôi là phải tìm mọi cách để ứng dụng Real-time PCR vào các bộ kit phát hiện bệnh trên người, thủy sản, gia cầm, gia súc, v.v… Rồi thỉnh thoảng tôi cũng tham gia phát triển các kit phát hiện vi khuẩn gây bệnh có trong thực phẩm như Salmonella, Listeria, v.v… Thế nên, sẽ không có gì là sai khi tôi tự nhận mình là một người chuyên về nghiên cứu ứng dụng hơn là nghiên cứu cơ bản.
Vậy mà, trong 4 năm trở lại đây, sau khi chuyển sang làm việc trong môi trường thương mại, tôi đã không ít lần liều lĩnh đi “bày vẽ” cho vài khách hàng cách dùng kỹ thuật sinh học phân tử cho nghiên cứu cơ bản. Và tất nhiên, kỹ thuật mà tôi hay “khua môi múa mép” nhất là Real-time PCR! Hôm nay, tôi xin phép ghi lại ở đây một chút hiểu biết hạn hẹp của mình về Ứng dụng Real-time PCR trong nghiên cứu tế bào gốc.
Tế bào gốc là những tế bào chưa biệt hóa có trong cơ thể chúng ta. Nhiệm vụ cốt lõi của chúng là cung cấp tế bào mới, bù đắp cho các tế bào cũ đã chết đi tại các cơ quan. Nghĩa là chúng giúp các cơ quan “tồn tại và phát triển bền vững” theo thời gian. Đặc tính quan trọng nhất của tế bào gốc là tính vạn năng (pluripotency). Nói nôm na, đặc tính này giúp cho tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Nhờ vào khả năng “siêu việt” này, từ Việt Nam cho đến thế giới, tế bào gốc đang được xem là một công cụ đầy tiềm năng để chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau. Ngoài ra, tế bào gốc còn được sử dụng như một mô hình lý tưởng cho các nghiên cứu và cả cho quá trình phát triển thuốc mới.
Trong các nghiên cứu sử dụng tế bào gốc hay trong các quy trình phát triển liệu pháp tế bào, điều người ta quan tâm là làm sao biết được những tế bào gốc đang được “nuôi” giữ được tính vạn năng của chúng. Một trong những cách để trả lời câu hỏi này là ứng dụng Real-time PCR để khảo sát biểu hiện của một số gen mã hóa cho các nhân tố phiên mã đặc trưng trong tế bào gốc. Những nhân tố phiên mã này giúp tạo ra và duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc. Nếu tế bào gốc bị mất biểu hiện của những nhân tố này, chúng sẽ mất đi tính vạn năng hoàn toàn. Tôi có thể kể ra ở đây một vài nhân tố phiên mã đã được biết đến nhiều như Oct-3/4, NANOG, FOX2D, SOX2, và UTF-1. Ngoài ra, người ta còn có thể khảo sát biểu hiện của các yếu tố điều hòa quan trọng như LIN28 (điều hòa dịch mã và sản xuất microRNA) và hTERT (enzyme phiên mã ngược telomerase của người).
Khi ứng dụng Real-time PCR (nên gọi chính xác là RT-qPCR, vì mục tiêu chính là định lượng RNA) trong quy trình khảo sát biểu hiện của các gen trên, đầu tiên chúng ta cần tách chiết RNA tổng số từ các tế bào gốc. Sau đó, RNA được chuyển thành cDNA bằng phản ứng reverse transcription. Cuối cùng, cDNA được bổ sung vào một vài phản ứng Real-time PCR có chứa sẵn các mồi và mẫu dò TaqMan đặc hiệu của gen mã hóa cho các nhân tố phiên mã nói trên. Thông thường, để đơn giản hóa, người ta chỉ sử dụng phản ứng 2-plex, tức là phát hiện 2 gen mục tiêu trong cùng 1 phản ứng với 2 kênh màu huỳnh quang khác nhau. Gen mục tiêu thứ nhất là một gen biểu hiện đặc trưng ở tế bào gốc, ví dụ Oct-3/4, với mẫu dò huỳnh quang đặc hiệu được đánh dấu màu FAM (màu huỳnh quang phổ biến nhất cho các ứng dụng Real-time PCR). Gen thứ hai là một gen đối chứng (housekeeping gene) với mẫu dò huỳnh quang đặc hiệu được đánh dấu màu HEX. Dựa trên kết quả so sánh giá trị Ct giữa gen mục tiêu và gen đối chứng, giữa mẫu áp dụng điều kiện khảo sát và mẫu đối chứng, chúng ta có thể biết được gen mục tiêu đang được biểu hiện mạnh hay yếu trong điều kiện khảo sát. Có thể bạn sẽ hỏi “Gen đối chứng là gen gì”? Gen đối chứng là những gen có biểu hiện đồng đều giữa tất cả các tế bào ngay cả ở những điều kiện thí nghiệm khác nhau. Thông thường, bạn có thể thấy đại đa số các bài báo khoa học thường dùng gen ACTB hay GADPH làm gen đối chứng cho những thí nghiệm khảo sát biểu hiện gen bằng Real-time PCR. Tuy nhiên, khi làm việc với tế bào gốc, nhiều nhóm nghiên cứu đã đề xuất những gen đối chứng có biểu hiện ổn định hơn ACTB và GADPH, ví dụ như TBP, PPIA, EID2, v.v… Và trước khi tiến hành đo đạc sự biểu hiện của gen mục tiêu, bạn nên khảo sát trước để chọn ra gen đối chứng ổn định nhất cho các thí nghiệm của bạn.
Đôi khi, bạn còn có thể thấy thêm một ứng dụng Real-time PCR trong việc đánh giá đặc tính của những tế bào đã biệt hóa từ tế bào gốc. Ví dụ, protein dạng sợi có tính a-xít của tế bào thần kinh đệm (glial fibrillary acidic protein) và protein 2 liên quan vi ống (microtubule associated protein 2) là 2 chỉ thị phân tử đặc trưng cho tế bào thần kinh tiền sinh (neural progenitor cells). Việc đánh giá mức độ biểu hiện của 2 gen GFAP và MAP-2 mã hóa cho 2 protein này cho chúng ta biết quá trình biệt hóa có thành công hay không. Trong khi đó, tế bào nội mô mạch là một mô hình rất tốt để nghiên cứu và thử nghiệm các loại thuốc điều trị bệnh về mạch máu. Thế nên, trong các nghiên cứu này, người ta hay ứng dụng Real-time PCR để khảo sát mức biểu hiện của 2 gen mã hóa cho thụ thể tăng trưởng nội mạch 2 (vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR2) và yếu tố von Willebrand ( von Willebrand factor, vWF). Những gen này thường biểu hiện mạnh ở tế bào nội mô mạch tiền sinh sau khi biệt hóa thành công.
(Còn tiếp)
Bài viết thuộc bản quyền của Sinh Học Phân Tử Bên Giảng Đường.
3,895 total views, 2 views today
